Een oraal vaccin voor SARS-CoV-2 RBD-mRNA-afgeleide exosomen uit koemelk induceert een neutraliserende antilichaamrespons in vivo

Leestijd: 18 minuten

Samenvatting:

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, heeft tal van uitdagingen voor de wereldgezondheid met zich meegebracht. De vaccins, waaronder op lipiden gebaseerde mRNA-nanopartikels, geïnactiveerd virus en gerecombineerd eiwit, zijn gebruikt om SARS-CoV-2-infecties in klinieken te voorkomen en zijn enorm nuttig tegen de epidemie. Hier presenteren wij voor het eerst een oraal mRNA-vaccin op basis van van koemelk afkomstige exosomen (melkexos), dat het SARS-CoV-2 receptorbindingsdomein (RBD) als immunogeen codeert. De resultaten wezen erop dat RBD-mRNA dat door van melk afkomstige exosomen wordt afgegeven, in 293 cellen in vitro afgescheiden RBD-peptide kan produceren en neutraliserende antilichamen tegen RBD bij muizen kan stimuleren. Deze resultaten wijzen erop dat een op rundermelk gebaseerd mRNA-vaccin op basis van exosomen kan dienen als een nieuwe strategie voor de preventie van SARS-CoV-2-infectie. Ondertussen kan het ook werken als een nieuw oraal toedieningssysteem voor mRNA.

Samenvatting in één zin Oraal SARS-CoV-2 mRNA-vaccin op basis van van koemelk afkomstige exosomen kan neutraliserende antilichamen bij muizen stimuleren.

Inleiding:

COVID-19 vertoont typisch symptomen die veel voorkomen bij luchtweginfecties, waaronder koorts en hoesten. Toch ontwikkelt het zich in veel gevallen tot een ernstiger ziekte die acute ademnood, verspreide ziekte en dood kan omvatten (1-3). Het SARS-CoV-2 spike-eiwit is een homotrimeer transmembraan glycoproteïne dat bestaat uit S1 en S2 subeenheden. Wanneer het spike-eiwit interageert met specifieke receptoren op gastheercellen, bevindt zijn receptorbindingsdomein (RBD) zich op de C-terminus van S1 en kan het zich specifiek binden aan de receptor angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2) en initieert het de membraanfusie tussen het virus en de gastheercel (4-7). Studies hebben aangetoond dat RBD het belangrijkste doelwit is van de meeste neutraliserende activiteit in immuunserum, wat suggereert dat RBD een potentieel doelwit kan zijn voor het 2019-nCoV-vaccin of de therapie (8-10).

Momenteel omvatten de beschikbare platforms voor COVID-19-vaccins geïnactiveerde vaccins, levende verzwakte vaccins, recombinante eiwitvaccins, virale vectorvaccins en nucleïnezuurvaccins (11). In 2021 toonden de inkomsten van COVID-19-vaccinproducten van wereldwijde belangrijke ondernemingen aan dat de inkomsten uit mRNA-vaccins van Pfizer en German BioNTechnology respectievelijk 367,8 miljard dollar en 213,6 miljard dollar bedroegen, goed voor meer dan de helft van het wereldwijde marktaandeel voor vaccins. Het mRNA-vaccin van Pfizer nam het grootste deel voor zijn rekening omdat het snel veel aandacht en promotie kreeg vanwege zijn veiligheid, hoge efficiëntie en korte productiecycli. Vergeleken met andere vaccintechnologieplatforms heeft het mRNA-vaccin ook deze voordelen, waaronder 1. een uitstekend immuuneffect; 2. een korte O&O-cyclus; 3. gemakkelijke productie op grote schaal (12, 13); 4. geen risico van infectie of genoomintegratie (14-16); 5. het menselijke expressiesysteem brengt antigenen tot expressie met een goede immunogene recovery (17); 6. de stimulering van humorale en cellulaire immuniteit (18, 19); 7. geen hulpstof, enzovoort. Maar mRNA-vaccins vertonen ook gebreken, met hoge technische belemmeringen en octrooibeperkingen voor de toedieningstechnologie; ze zijn instabiel en moeilijk te bewaren en te vervoeren. Traditioneel is er een intramusculaire injectie en een professionele operatie voor nodig.

De meeste vaccins die nu klinische proeven ondergaan, worden intramusculair of subcutaan geïnjecteerd, waardoor de immuunactivatie beperkt blijft tot de weinige drainerende lymfeklieren (20, 21). Aangenomen wordt dat orale toediening een hoger veiligheidsprofiel, een betere therapietrouw en lagere medische kosten heeft dan injectie (20, 22). De moeilijkheden van de complexe gastro-intestinale omgeving en de darmepitheelbarrières hebben het gebruik van orale vaccins beperkt. Om te kunnen reageren met de overvloedige immuuncellen in de lamina prima, moet een ideaal oraal vaccin het maag-darm milieu verdragen en de darm-epitheliale barrières overwinnen (23).

Exosomen zijn celafgeleide, membraneuze blaasjes die in bijna alle lichaamsvloeistoffen aanwezig zijn. Met afmetingen die variëren van 35-120 nm in diameter, zijn exosomen samengesteld uit een fosfolipidenbillaag afkomstig van het membraan van de cel van oorsprong. Exosomen hebben recentelijk aandacht gekregen vanwege hun natuurlijke rol bij het vervoeren van moleculaire ladingen (bv. DNA, kleine RNA’s, eiwitten en lipiden) tussen verre cellen in het lichaam. Het is bevestigd dat rundermelk rijk is aan exosomen en een vergelijkbaar potentieel vertoont om te dienen als nanocarriers voor het afleveren van geneesmiddelen (24). Melk is een meer betaalbare en toegankelijke bron in vergelijking met celkweekmedia. Bovendien kunnen melkexosomen extra voordelen bieden als van nature gewenste orale toedieningsdragers, wat erop wijst dat melkexosomen een meer geschikte en patiëntvriendelijke therapeutische modaliteit vormen (25). Rekening houdend met de biologische eigenschappen van melkexosomen en het overwinnen van de technologische uitdagingen van mRNA-vaccins, hebben wij momenteel een methode beschreven voor het maken van melkexosomen die geladen zijn met RBD-mRNA, hun effectiviteit geëvalueerd bij het afleveren van functioneel mRNA, een nieuw oraal vaccintechnologieplatform ontwikkeld op basis van melkexosomen en de voorlopige werkzaamheid onderzocht van het nieuwe orale vaccin op basis van melkexosomen bij muizen om humorale immuniteit op te wekken tegen SARS-CoV-2 spike-eiwitten.

Resultaten

Bereiding van van koemelk afkomstige exosomen

Om onze bereidingsmethoden te evalueren werden van koemelk afkomstige exosomen (melk-exosomen) geïsoleerd en gezuiverd door dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie (DC) (fig. 1A). Zes componenten werden verzameld door DC, waaronder F1 was ongeveer 5 mL, en F2 tot F6 waren alle 7 mL (Fig. 1B). Om de geïsoleerde melkexosomen biofysisch te karakteriseren, werden biomarkers (CD9, TGS110) en morfologie gebruikt om de exosomen bevattende fractie te bepalen. Exosomen waren voornamelijk geconcentreerd in F3 en F4 (Fig. 1C, D). De morfologie vertoonde een rijke overvloed aan gemengde populaties exosomen met overwegend intacte blaasjes die overeenkomen met de klassieke exosoomachtige morfologie en een typische bekerachtige structuur (fig. 1D). In 0,95 mol/L-1,30 mol/L sucrose werden melkexosomen waargenomen met een diameter van 30-150 nm. Aangezien de fracties 3 en 4 verrijkt waren met exosomen, werden zij samengevoegd voor verdere analyse.

Figuur 1.

Identificatie van uit koemelk afkomstige exosomen in fracties van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.

(A) Schematische weergave van de belangrijkste stappen bij het isoleren van exosomen uit rauwe koemelk. (B) F1-F6 staan voor de overeenkomstige concentraties sucrose. (C) De exosoomsuspensie werd geanalyseerd door middel van western blot. Immunoblots toonden exosoommarker in verschillende melkexosoomfracties. +, positieve controle (het eiwit van HaCat-cellen); -, negatieve controle (het eiwit van Hela-cellen). (D) De morfologie van verschillende fracties verkregen door TEM. (Schaalbalken = 500 nm).

Zuivering en karakterisering van van koemelk afkomstige exosomen door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie

De morfologie van de samengevoegde exosoomfractie vertoonde een rijke overvloed aan exosomen die overeenkwamen met de klassieke exosoomachtige morfologie (fig. 2A), de grootteverdeling (fig. 2B) en eiwitmarkers (fig. 2C). Een drieweg Venn-diagram van eiwitten onthulde 1022 eiwitten die alle datasets gemeen hebben, en 961 eiwitten werden gemeenschappelijk geïdentificeerd in alle drie DC-milk-exosomen, zoals getoond in figuur 2C. Proteomics-analyse van de monsters toonde aan dat exosome-eiwitlysaten werden bereid en geverifieerd met clusteranalyse voor vitale exosomale membraanmarkers CD9, CD63, CD81 en TSG101. De afwezigheid van de markers GM130 en calnexine van het oppervlak van de microdeeltjes, alsmede de afwezigheid van de marker calnexine van het endoplasmatisch reticulum (ER), bevestigde dat de geïsoleerde melkexosomen niet waren verontreinigd met andere multivesiculaire lichamen (fig. 2C). Drie partijen van boviene melk afgeleide exosomen verkregen door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DC-milk-exos) werden geanalyseerd en gaven aan dat er geen verschillen waren tussen meerdere partijen DC-milk-exos.

Figuur 2.

Karakterisering van DC-milk-exos.

(A)De morfologie en (B) de analyse van de deeltjesgrootte werden gedetecteerd met respectievelijk TEM en nanoFCM. (C) Een drieweg Venn-diagram van eiwitten uit drie partijen DC-milk-exos onthulde 1022 eiwitten gemeenschappelijk voor alle datasets. Clusteranalyse voor essentiële exosomale membraanmerkers CD9, CD63, CD81, TSG101, microvesikel-oppervlaktemerkers GM130, en endoplasmatisch reticulum (ER)-merker calnexine zijn aangegeven in de tabel. Afkortingen: TEM, transmissie-elektronenmicroscoop; DC-milk-exos, van koemelk afkomstige exosomen door dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie. Schaalstaven = 500 nm.

Laden van RBD-mRNA van melk afgeleide exosomen

Om te bepalen of DC-melk-exosomen geladen kunnen worden met exogene, in vitro gesynthetiseerde mRNA’s, ontwierpen en synthetiseerden wij een testreceptor bindingsdomein (RBD) mRNA dat codeert voor immunogene vormen van de SARS-CoV-2 spike. Het RBD-coderingssequentiegebied (CDS) is 675 basisparen (bp) lang en heeft de FLAG-tag. Onderzoek van het in vitro gesynthetiseerde RBD-mRNA met behulp van een bioanalyzer (Agilent) bevestigde dat het RBD-mRNA-monster liep als een enkele band van 1100 bps (Fig. 3A), in overeenstemming met de grootte die we verwachtten te ontwerpen in vitro transcriptie. Om de functionaliteit te beoordelen, werd de RBD mRNA getransfecteerd in 293T cellen, en RBD peptide expressie werd ondervraagd de volgende dag door western blot (Fig. 3B). Deze resultaten gaven aan dat RBD mRNA werd gesynthetiseerd volgens in vitro transcriptie (IVT) en een translationele functie had die kon worden vertaald in RBD-eiwit in cellen.

Figuur 3.

Karakterisering van SARS-CoV-2 receptor binding domain (RBD) mRNA.

(A) Gel-achtig beeld van in vitro gesynthetiseerd RBD-mRNA, onderzocht met een RNA-chip op een Agilent Bioanalyzer. Gegevens voor RNA-markers, RBD-mRNA, worden van links naar rechts gepresenteerd. (B) Western blot voor SARS-CoV-2 RBD eiwit expressie in 293T cellen wanneer de RBD mRNA werd getransfecteerd in 293T cellen met een extra 24 uur behandeling samen met 1 ug en 3 ug RBD mRNA. Lanen 1-3: controle; Lanen 4-6: 1 μg RBD-293T; Lanen 7-9: 3 μg RBD-293T.

Om het IVT RBD-mRNA in DC-melk-exos te laden, mengden we het eerst met kationische lipiden (DOTAP) om lipide-mRNA’s te genereren. Vervolgens laadden we het lipide-mRNA in DC-melk-exos door mengen-geïnduceerde partitionering (Fig. 4A). Beide processen worden aangedreven door de aantrekkingskracht van de lading, wat resulteert in de inkapseling van lipide-mRNA’s in Milk-exos membranen. Om de RBD-mRNA-melk-exos biofysisch te karakteriseren, werden de morfologie en de grootteverdeling en zetapotentiaalanalyse uitgevoerd (Fig. 4B-D). Om de laadefficiëntie van dit proces te bepalen, werden de producten van drie onafhankelijke mRNA-laadreacties onderzocht. Een op TaqMan gebaseerde real-time kwantitatieve PCR-test toonde aan dat de laadefficiëntie 57,3% bedroeg (Fig. 4E).

Figuur 4.

Karakterisering van het op melk gebaseerde exosoomvaccin voor SARS-CoV-2.

(A) Stroomdiagram van de vaccinbereiding voor SARS-CoV-2. De morfologie (B), deeltjesgrootteverdeling (C), zetapotentiaalanalyse (D) en RBD-mRNA-laadefficiëntie (E) werden uitgevoerd. Schaalstaven = 500 nm.  

Verificatie van orale vaccins voor RBD-mRNA-DC-milk-exos in vitro en in vivo

Vervolgens hebben we getest of Milk-exos geladen met RBD-mRNA functioneel RBD-mRNA in menselijke cellen kon afleveren. Western blot en ELISA resultaten vastgesteld dat RBD mRNA geladen Milk-exos kon mRNA leveren in 293 cellen en produceren RBD peptide 24 uur later. (Fig. 5A, B, p<0,01).

Figuur 5.

Met mRNA geladen exosomen leveren functioneel SARS-CoV-2 RBD-mRNA aan menselijke cellen in vitro.

(A) Western blot analyse van de expressie van RBD mRNA afgeleverd door oraal vaccin in 293T cellen. (B) De ELISA-detectie van RBD uitgedrukt in 293T-cellysaat en afgescheiden in het kweeksupernatant na 24 uur na de transfectie van het op melk gebaseerde exosoomvaccin. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde standaardafwijking met een groepsgrootte van drie. **P < 0,01 vs. PBS.

Om het vermogen om neutraliserende antilichamen te stimuleren verder te bevestigen, werd RBD mRNA-milk-exos geïnjecteerd in het duodenum (i. d.) van 9-11 weken oude vrouwelijke BALB/c muizen (fig. 6A). Bloed (0,1 mL) werd verzameld op dagen 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 en 49 voor antilichaamdetectie voordat de dieren werden opgeofferd. Met behulp van ELISA-kits, aangepast voor het opsporen van antilichamen afkomstig van muizen, hebben wij waargenomen dat gevaccineerde dieren na de tweede injectie een relatief constant niveau van neutraliserende antilichamen tegen RBD produceerden (Fig. 6B, C).

Figuur 6.

Validatie van met SARS-CoV-2 RBD mRNA geladen melkexosomen die functioneel SARS-CoV-2 RBD mRNA in vivo leveren.

(A) Muisimmunisatie en serumbemonsteringsschema. BALB/c muizen kregen dezelfde doses van een oraal vaccin voor de op SARS-CoV-2 gebaseerde melkafgeleide exosomen (N = 5) of de controle zoutoplossing (N = 3) op dag 0 en werden opnieuw geboost op dagen 14 en 35. Sera werden verzameld op dag 0 (vóór de vaccinatie), 7, 14, 21, 28, 35, 42 en 49 (na de vaccinatie). De blauwe en rode pijl staan voor de tijdstippen van respectievelijk immunisatie en bloedafname. (B) De neutraliserende antilichamen van het orale vaccin voor SARS-CoV-2-gebaseerde melkafgeleide exosomen in serum werden bepaald door ELISA. De rode stippellijn vertegenwoordigde de cutoff-waarde van neutraliserende antilichamen tegen het RBD-peptide. N = 3 (controle), N = 5 (RBD-DC-melk-exos), en de gegevens worden weergegeven als gemiddelde±STD. **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. controlegroep

Bespreking

In deze studie hebben wij aangetoond dat een oraal vaccin voor SARS-CoV-2 op basis van uit koemelk afkomstige exosomen in vitro en in vivo functioneel mRNA kan afleveren en antilichaamreacties tegen SARS kan opwekken. Eerst controleerden we met succes de technische haalbaarheid van orale toediening van mRNA op basis van uit koemelk afkomstige exosomen als toedieningsmiddel.

In vergelijking met injectie werd orale toediening algemeen beschouwd als een beter veiligheidsprofiel, een betere therapietrouw van de patiënt en lagere medische kosten (20, 22). Net als liposomen hebben exosomen een bi-lipidemembraan en een waterige kern; daarom kunnen zij potentieel worden geladen met hydrofiele en lipofiele geneesmiddelen (26). De praktische toepassing van op exosomen gebaseerde therapeutica in klinische transformatie blijft echter een uitdaging. Veel studies isoleerden exosomen uit celkweekmedia met een laag rendement en lage kosten, waardoor opschaling van de productie moeilijk is (27). Een kosteneffectieve en schaalbare bron moet worden geoptimaliseerd op basis van de huidige beperkingen.

Het werd gemeld dat rundermelk-afgeleide exosomen vertoonden een soortgelijk potentieel om te dienen als drug-delivery nanocarriers (24). Melk was een meer betaalbare en toegankelijke bron in vergelijking met celkweekmedia. Bovendien zouden van rundermelk afkomstige exosomen extra voordelen kunnen bieden als van nature gewenste dragers voor orale toediening, wat erop wijst dat van rundermelk afkomstige exosomen een geschiktere en patiëntvriendelijke therapeutische modaliteit vormen (25).

Hierin presenteerden wij een oraal vaccin dat verschilde van eerdere op nanomaterialen gebaseerde orale vaccintoedieningstechnologieën, omdat het uit rundermelk afkomstige exosomen bevatte, en het uit melk afkomstige exosoom-afgeleide orale COVID-19 mRNA-vaccin zijn technologie voor toediening en industrialisatie had. Hoewel de resultaten van deze studie wezen op de gunstige effecten van een oraal vaccin voor de preventie van het nieuwe coronavirus en een potentieel regime boden voor klinische toepassing, moesten wij in toekomstige studies het aantal dieren uitbreiden en de werkzaamheid van het orale vaccin in verschillende diermodellen (zoals grote dieren) verder verifiëren. Bovendien moesten de precieze moleculaire mechanismen en de veiligheid verder worden onderzocht.

Hoewel density-gradient ultracentrifugatie de gouden standaard is voor de isolatie en zuivering van exosomen, zijn er verscheidene studies verricht naar de extractie van exosomen uit koemelk met behulp van differentiële centrifugatie alleen (28, 29) of precipitatie (30, 31) technieken. In combinatie met differentiële centrifugatie gebruikten wij de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatiemethoden om exosomen uit melk te isoleren die in wezen vrij waren van verontreiniging door microvesicles. De uiteindelijke monsterzuiverheid kon 100% bereiken. De in deze studie gebruikte techniek om exosomen te zuiveren is daarentegen onverenigbaar met grootschalige productie van exosomen. Het goede nieuws is dat wij het op chromatografie gebaseerde nieuwe productieproces hebben vastgesteld om exosomen uit rundermelk te zuiveren met een betere kwaliteit dan productie door DC (gegevens worden niet getoond).

Het zal snel komen dat een mRNA delivery systeem op basis van melk-afgeleide exosomen zal dienen als een platform voor mRNA therapeutica ontwikkeling in de recente toekomst.

Materialen en methoden

Cellijnen en celkweek

293T-cellen (SCSP-502) (menselijke embryonale nierepitheelcellen) werden gekocht van de Celbank van het Comité voor het behoud van de typische cultuur, Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). 293T cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/strep oplossing bij 37 ° C en 5% CO2 concentratie in een bevochtigde atmosfeer. De samengevoegde cellen werden onderhouden in DMEM met 10% (vol/vol) FBS, waarbij het medium om de dag werd ververst. Wanneer de confluentie van de gekweekte cellen 80% bereikte, werden ze losgemaakt door behandeling met 0,25% (wt/vol) trypsine en 0,1% (wt/vol) ethyleendiaminetetra-azijnzuur (Gibco) en opnieuw uitgezaaid bij een dichtheid van 1 × 104 cellen per cm2. Gekweekte cellen vóór passage twee werden gebruikt voor experimenten. Voor RBD mRNA expressie in vitro, werden cellen getransfecteerd met mRNA met behulp van Lipofectamine Messenger MAX, zoals voorgesteld door de fabrikant (Thermo Fisher).

Dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie zuivering van melk-exos (De DC-melk-exos)

Melkexosomen werden geïsoleerd door density-gradient ultracentrifugatie (DC). Kort gezegd werd de caseïnevrije wei gecentrifugeerd bij 100.000 g (Beckman Coulter, VS) gedurende 105 minuten om de melkexos te precipiteren, en geresuspendeerd in 1 ml PBS. De geconcentreerde melkexos werden onderworpen aan de bovenkant van een discontinue dichtheidsgradiënt bestaande uit 2 mol/L, 1,65 mol/L, 1,3 mol/L, 0,95 mol/L, en 0,6 mol/L sucrose (7 mL volume voor elke hoek) in 250 mM Tris-HCl oplossing (pH 7,4). Ze werden gecentrifugeerd bij 100.000 g bij 4 °C gedurende 20 uur. De melk-exo-fractie tussen fracties 3 (1,3 mol/L) en 4 (1,65 mol/L) werd verzameld. Om sucrose te verwijderen werd de fractie verdund in PBS tot een eindvolume van 40 ml en gecentrifugeerd bij 100.000 g bij 4 °C gedurende 105 min. De pellet werd geresuspendeerd in 1 mL PBS. De DC-melk-exo’s werden vóór gebruik bij -80 °C bewaard.

Karakterisering van de DC-milk-exos morfologie door transmissie-elektronenmicroscopie

De DC-milk-exos morfologie werd bestudeerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals eerder beschreven, met enkele wijzigingen. Eerst werden de DC-milk-exos (100 μg/mL) gefixeerd door vermenging met een gelijk volume van 4% (w/v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Het geselecteerde monster (10 pi) werd vervolgens onderworpen aan een formvar-koolstof gecoat TEM-rooster en gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bewaard. Het rooster werd gekleurd door toevoeging van 10 pi uranyloxalaatoplossing (4% uranylacetaat, 0,0075 M oxaalzuur, pH 7). Het gemerkte rooster werd onderzocht met een Hitachi 5600 plus transmissie-elektronenmicroscoop bij 120 KV en 50.000 vergroting.

Meting van de deeltjesgrootteverdeling van DC-melk-exos door NanoFCM

De deeltjesgrootte en het aantal melk-exosmonsters werden gekarakteriseerd door het NanoFCM-instrument (NanoFCM Inc., Xiamen, China) volgens de gebruiksaanwijzing. Een silica nanosphere cocktail (Cat. S16M-Exo, NanoFCM Inc, Xiamen, China) met een mengsel van 68 nm, 91 nm, 113 nm, en 155 nm standaardkorrels werd gebruikt om het instrument in te stellen voor de meting van de deeltjesgrootte. De instrumentele parameters werden als volgt ingesteld: Laser, 10 mW, 488 nm; SS verval, 10%; sampling druk, 1,0 kPa; sampling periode, 100 μs; tijd om te registreren, 1 min.

Proteomics

De proteomics van DC-milk-exos werd geanalyseerd door LC-MS/MS met behulp van Easy NLC1200-Q Exactive en Fusion Lumos Orbitrap massaspectrometers (ThermoFisher), beide uitgerust met nanoflow reversed-phase HPLC (Ultimate 3000 RSLC, Dionex). Het nano-HPLC-systeem was uitgerust met een Acclaim PepMap nano-trap-kolom (Dionex-C18, 100 Å, 75 μm × 2 cm) en een Acclaim Pepmap RSLC analytische kolom (Dionex-C18, 100 Å, 75 μm × 25 cm). Typisch, voor elke LC-MS / MS experiment, 1 pi van het peptide mix werd geladen op de verrijking (trap) kolom op een isocratische stroom van 5 pi / min van 3% CH3CN met 0,1% mierenzuur gedurende 5 minuten voordat de verrijking kolom werd geschakeld in-line met de analytische kolom. De voor de LC gebruikte eluenten waren 0,1% (v/v) mierenzuur (oplosmiddel A) en 100% CH3CN/0,1% (v/v) mierenzuur. De gebruikte gradiënt was 3% B tot 25% B gedurende 23 min, 25% B tot 40% B in 2 min, 40% B tot 85% B in 2 min, en gehandhaafd op 85% B gedurende 2 min vóór equilibratie gedurende 10 min bij 3% B vóór de volgende injectie. Alle spectra werden verzameld in positieve modus met full-scan MS-spectra die in de FT-modus scannen van m/z 300-1650 bij resoluties van 70.000 (QE) en 120.000 (Lumos). Voor beide instrumenten werd een lock-massa van 445,12003 m/z gebruikt. Voor MS/MS op de Lumos werd de “top speed” acquisitiemodus (3 s cyclustijd) op de meest intense precursor gebruikt, waarbij peptide-ionen met ladingstoestanden ≥2 werden geïsoleerd met een isolatievenster van 1,6 m/z en gefragmenteerd met HCD met een genormaliseerde botsingsenergie van 35. Voor MSMS op de QE plus werden de 15 meest intense peptide-ionen met ladingstoestand ≥2 geïsoleerd met een isolatievenster van 1,6 m/z en gefragmenteerd door HCD met een genormaliseerde botsingsenergie van 35. Er werd een dynamische uitsluiting van 30 seconden toegepast.

De ruwe bestanden werden doorzocht met Proteome Discover (versie 2.1, Thermo Fisher, Duitsland) met Sequest als zoekmachine. Fragment- en peptidemassatoleranties werden ingesteld op respectievelijk 20 mDa en 10 ppm, waarbij maximaal 2 gemiste splitsingsplaatsen werden toegestaan. Het percentage foutieve ontdekkingen van eiwitten, peptiden en fosfosieten was 1 procent. De differentiële expressie-eiwitten werden geanalyseerd door DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) Bioinformatics Resource 2021 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) met aanbevolen analytische parameters om de meest significant verrijkte signaaltransductiepaden in de dataset te identificeren.

Western blot

Totale cellulaire en melkexo-eiwitten werden geëxtraheerd met RIPA-lysebuffer, en de eiwitconcentratie werd bepaald met een BCA-eiwitbepalingskit (Thermo, A53226). Vervolgens werd het eiwit geladen op SDS-polyacrylamidegelelektroforese-gels. Na de elektroforese werden de eiwitten overgebracht op een polyvinylideenfluoridemembraan en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in 5% (wt/vol) runderserumalbumine (BSA). Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met anti-TSG101 (Abcam, ab125011), anti-CD9 (Abcam, ab92726), anti-RBD (Abcam, ab277628), of anti-GAPDH (Proteintech, 60004-1) gedurende één nacht bij 4 °C. Na wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween (TBST), werd het mierikswortelperoxidase (HRP) secundaire antilichaam verdund 1: 10.000 met 5% (wt/vol) BSA en geïncubeerd met het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Overtollig secundair antilichaam werd van het membraan gespoeld met TBST, en een chemiluminescent signaal werd gegenereerd met het FluorChem E-systeem (ProteinSimple, VS) volgens het protocol van de fabrikant.

Meting van zetapotentiaal

De zetapotentiaal van melkexosomen werd driemaal gemeten bij 25 °C onder de volgende instellingen: gevoeligheid van 85, een sluiterwaarde van 70 en een beeldsnelheid van 30 beelden per seconde, terwijl ZetaView-software werd gebruikt om de gegevens te verzamelen en te analyseren.

Bouw van een oraal vaccin voor SARS-CoV-2 RBD-gebaseerd DC-melk-afgeleide exosomen (RBD-DC-melk-exos)

mRNA ontworpen om de RBD-eiwitten tot expressie te brengen werd verkregen van een commerciële leverancier (Novoprotein). RBD-mRNA’s werden gezuiverd met behulp van CIMmultus Oligo dT-kolommen en geresuspendeerd in DNase- en RNase-vrij water met behulp van nuclease-vrije tips en buizen. Gezuiverde RBD-mRNA’s werden voorbereid voor het laden in DC-milk-exos door ze te preïncuberen met kationische lipiden, waardoor een lipide-mRNA-product ontstond. Lipide-mRNA’s werden vervolgens door mengen en incuberen in gezuiverde DC-milk-exos geladen om een oraal vaccin te construeren. De morfologie, deeltjesgrootteverdeling en zetapotentiaal van met RBD-mRNA geladen DC-milk-exos werden gekarakteriseerd met respectievelijk TEM, het NanoFCM-instrument en Zeta Pals. RBD mRNA-laadefficiëntie werd gedetecteerd door Taqman-gebaseerde kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). RBD mRNA expressie werd gemeten met behulp van western blot en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RNA-extractie en Taqman-gebaseerde RT-qPCR-test

Totaal RNA werd uit het RBD-DC-milk-exos geëxtraheerd met TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA). Eerste-streng cDNA werd gesynthetiseerd met de PrimeScript™ RT Kit (TaKaRa, Beijing, China) en gebruikt als sjabloon om de expressie van RBD-genen te bepalen met de aangegeven primers en probes. De volgende primer-sequenties werden gebruikt: RBD, forward 5′-CTCCAGGGCAA ACTGGAAAG-3′, en reverse 5′-AATTACCACCAACCTTAGAATCAAG-3′, probe, CCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAG, met behulp van Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) reagens (TaKaRa, Beijing, China) in qRT-PCR. De cyclische parameters waren als volgt: een PCR-reactie werd uitgevoerd op 50 ng cDNA-monsters met 0,2 μmol/L van elke primer, 0,4 μmol/L RBD-probe en 10 μL 2×Premix Ex Taq Mix. De volgende condities werden gebruikt: 95 °C gedurende 30 s, 40 cycli bij 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 31 s in een Thermofisher QuantStudio5 en geanalyseerd met de daarvoor bestemde software.

ELISA-test

Het cellysaat, het kweeksupernatant en het serum werden gehomogeniseerd voor eiwitextractie. De expressie van het spikeiwit RBD (Beyotime, Shanghai, China) en het neutraliserende antilichaam (Vazyme, Nanjing, China) werd bepaald met ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

Meting van RBD-activiteit in vitro

We hebben getest of een oraal vaccin voor SARS-CoV-2 RBD op basis van DC-melkafgeleide exosomen (RBD-DC-melk-exos) functioneel RBD-mRNA in menselijke cellen kon afleveren. Voor in vitro studies voegde het orale vaccin de resulterende formuleringen toe aan culturen van menselijke cellen, liet de cellen ’s nachts groeien om RBD-mRNA-opname en -expressie mogelijk te maken, en testte vervolgens de cellen op RBD-activiteit door middel van western blot en ELISA.

Verificatie van de toedieningsfunctie van RBD-DC-milk-exos in vivo

We gebruikten vrouwelijke BALB/c-muizen met dezelfde leeftijd (Speford (Beijing) Biotechnology Co, Ltd.). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik en werden goedgekeurd door de Experimental Animal Ethics Committee van Youji (Tianjin) Pharmaceutical Technology Co. (IACUC-20220726-05.00). Vrouwelijke BALB/c-muizen (23~26 g, Speford, Beijing, China) werden gehuisvest in een pathogeenvrije faciliteit met standaardomstandigheden van temperatuur 24 °C, een licht-donkercyclus van 12 uur en voedsel en water ad libitum. De muizen werden gebruikt om de activiteit van RBD mRNA-DC-milk-exos, toegediend via duodenale injectie, te bestuderen. Muizen werden willekeurig verdeeld in 2 groepen: 1) de controlegroep (zoutoplossing, 1000 μL) (N = 3); en 2) de RBD-DC-milk-exos (0,5 mg mRNA/1000 μL) groep (N = 5). Alle behandelingen werden gestart met een duodenale injectie op dag 1, 15 en 36. Alle muizen werden twee weken na de laatste behandeling opgeofferd met 1% isofluraan. Bloed werd verzameld op verschillende tijdstippen (dagen 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 en 49). Verificatie van neutraliserende antilichamen van het orale vaccin voor SARS-CoV-2 op basis van melkafgeleide exosomen in vivo werd uitgevoerd door ELISA-analyse in serum. N = 3 (controle), N = 5 (RBD-mRNA-DC-melk-exos), en de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± STD. **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. controlegroep.

Statistische analyses

De gegevens werden weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie. Een ongepaarde studententest werd gebruikt om gegevens met slechts twee sets te analyseren. Een eenzijdige variantieanalyse (ANOVA) werd uitgevoerd om te bepalen of er een significant verschil was tussen meer dan twee datasets, gevolgd door Bonferroni’s post hoc test met behulp van GraphPad Prism 6.0. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant voor groepsverschillen. Een sterretje (*) stond voor P < 0,05; een dubbel sterretje (**) stond voor P < 0,01; een drievoudig sterretje (***) stond voor P < 0,001.

Bron: Quan Zhang, Miao Wang, Chunle Han, Zhijun Wen, Xiaozhu Meng, Dongli Qi, Na Wang, Huanqing Du, Jianhong Wang, Lu Lu, Xiaohu Ge

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.19.517879v1.full

Verwijzingen:

1. Yang X, Yu Y, Xu J, Shu H, Xia J, Liu H, et al. Clinical course and outcomes of critically ill patients with SARS-CoV-2 pneumonia in Wuhan, China: a single-centered, retrospective, observational study. Lancet Respir Med (2020) 8(5): 475–481. doi: 10.1016/S2213-2600(20)30079-5 CrossRefPubMedGoogle Scholar
2. Lauer SA, Grantz KH, Bi Q, Jones FK, Zheng Q, Meredith HR, et al. The Incubation Period of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) From Publicly Reported Confirmed Cases: Estimation and Application. Ann Intern Med (2020) 172(9): 577–582. doi: 10.7326/M20-0504 CrossRefPubMedGoogle Scholar
3. Huang NE, Qiao F. A data driven time-dependent transmission rate for tracking an epidemic: a case study of 2019-nCoV. Sci Bull (Beijing) (2020) 65(6): 425–427. doi: 10.1016/j.scib.2020.02.005 CrossRefGoogle Scholar
4. Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature (2020) 579(7798):270–273. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7 CrossRefPubMedGoogle Scholar
5. Walls AC, Park YJ, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell (2020) 183(6):1735. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058 CrossRefPubMedGoogle Scholar
6. Letko M, Marzi A, Munster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat Microbiol (2020) 5(4):562–569. doi: 10.1038/s41564-020-0688-y CrossRefPubMedGoogle Scholar
7. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Kruger N, Herrler T, Erichsen S, et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020) 181(2):271–280.e278. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052 CrossRefPubMedGoogle Scholar
8. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, Sui J, Wong SK, Berne MA, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature (2003) 426(6965):450–454. doi: 10.1038/nature02145 CrossRefPubMedGoogle Scholar
9. Li F, Li W, Farzan M, Harrison SC. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science (2005) 309(5742):1864–1868. doi: 10.1126/science.1116480 Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
10. Andersen KG, Rambaut A, Lipkin WI, Holmes EC, Garry RF. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat Med (2020) 26(4):450–452. doi: 10.1038/s41591-020-0820-9 CrossRefPubMedGoogle Scholar
11. Hossain MK, Hassanzadeganroudsari M, Feehan J, Apostolopoulos V. The race for a COVID-19 vaccine: where are we up to? Expert Rev Vaccines (2022) 21(3):355–376. doi: 10.1080/14760584.2022.2021074 CrossRefGoogle Scholar
12. Polack FP, Thomas SJ, Kitchin N, Absalon J, Gurtman A, Lockhart S, et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA covid-19 vaccine. New Engl J Med (2020) 383(27):2603–2615. doi: 10.1056/NEJMoa2034577 CrossRefPubMedGoogle Scholar
13. Ho W, Gao M, Li F, Li Z, Zhang XQ, Xu X. Next-generation vaccines: Nanop-articl-mediated DNA and mRNA delivery. Adv Healthc Mater (2021) 10(8):e2001812. doi: 10.1002/adhm CrossRefGoogle Scholar
14. Kariko K, Muramatsu H, Welsh FA, Ludwig J, Kato H, Akira S, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther (2008) 16(11):1833–1840. doi: 10.1038/mt.2008.200 CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
15. Thess A, Grund S, Mui BL, Hope MJ, Baumhof P, Fotin-Mleczek M, et al. Sequence-engineered mRNA without chemical nucleoside modifications enables an effective protein herapy in large animals. Mol Ther (2015) 23(9):1456–1464. doi: 10.1038/mt.2015.103 CrossRefPubMedGoogle Scholar
16. Kariko K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res (2011) 39(21):e142. doi: 10.1093/nar/gkr695 CrossRefPubMedGoogle Scholar
17. Alberer M, Gnad-Vogt U, Hong HS, Mehr KT, Backert L, Finak G, et al. Safety and immunogenicity of a mRNA rabies vaccine in healthy adults: An open-label, non-randomised, prospective, first-in-human phase I clinicia trial. Lancet (2017) 390(10101):1511–1520. doi: 10.1016/S0140-6736(17)31665-3 CrossRefGoogle Scholar
18. Zhang Z, Mateus J, Coelho CH, Dan JM, Moderbacher CR, Galvez RI, et al. Humoral and cellular immune memory to four COVID19 vaccines. Cell. (2022) 185(14):2434–2451. doi: 10.1016/j.cell.2022.05.022 CrossRefPubMedGoogle Scholar
19. Laczko D, Hogan MJ, Toulmin SA, Hicks P, Lederer K, Gaudette BT, et al. A single immunization with nucleoside-modified mRNA vaccines elicits strong cellular and humoral immune responses against SARS-CoV-2 in mice. Immunity (2020) 53(4):724–732e7. doi: 10.1016/j.immuni.2020.07.019 CrossRefPubMedGoogle Scholar
20. Vela Ramirez JE, Sharpe LA, Peppas NA. Current state and challenges in developing oral vaccines. Adv Drug Deliv Rev (2017) 114, 116–131. doi: 10.1016/j.addr.2017.04.008 CrossRefGoogle Scholar
21. Qin H, Zhao R, Qin Y, Zhu J, Chen L, Di C, et al. Development of a cancer vaccine using in vivo click-chemistry-mediated active lymph node accumulation for improved immunotherapy. Adv Mater (2021) 33(20): e2006007. doi: 10.1002/adma.202006007 CrossRefGoogle Scholar
22. Taddio A, Ipp M, Thivakaran S, Jamal A, Parikh C, Smart S, et al. Survey of the prevalence of immunization non-compliance due to needle fears in children and adults. Vaccine (2012) 30(32):4807–4812. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.05.011 CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
23. Kim SH, Jang YS. The development of mucosal vaccines for both mucosal and systemic immune induction and the roles played by adjuvants. Clin Exp Vaccine Res (2017) 6(1):15–21. doi: 10.7774/cevr.2017.6.1.15 CrossRefPubMedGoogle Scholar
24. Somiya M, Yoshioka Y, Ochiya T. Biocompatibility of highly purified bovine milk-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles (2018) 7(1):1440132. doi:10.1080/20013078.2018.1440132 CrossRefGoogle Scholar
25. Li D, Yao S, Zhou Z, Shi J, Huang Z, Wu Z. Hyaluronan decoration of milk exosomes directs tumor-specific delivery of doxorubicin. Carbohydr Res (2020) 493:108032. doi:10.1016/j.carres.2020.108032 CrossRefGoogle Scholar
26. Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta (2012) 1820(7):940–948. doi: 10.1016/j.bbagen.2012.03.017 CrossRefPubMedGoogle Scholar
27. Aqil F, Munagala R, Jeyabalan J, Agrawal AK, Kyakulaga AH, Wilcher SA, et al. Milk exosomes-natural nanoparticles for siRNA delivery. Cancer Lett (2019) 449:186–195. doi:10.1016/j.canlet.2019.02.011 CrossRefGoogle Scholar
28. Wolf T, Baier SR, Zempleni J. The intestinal transport of bovine milk exosomes is mediated by endocytosis in human colon carcinoma Caco-2 cells and rat small intestinal IEC-6 cells. J Nutr (2015) 145(10):2201–2206. doi: 10.3945/jn.115.218586 Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
29. Izumi H, Tsuda M, Sato Y, Kosaka N, Ochiya T, Iwamoto H, et al., Bovine milk exosomes contain microRNA and mRNA and are taken up by human macrophages. J Dairy Sci (2015) 98(5):2920–2933. doi: 10.3168/jds.2014-9076 CrossRefPubMedGoogle Scholar
30. Pieters BC, Arntz OJ, Bennink MB, Broeren MG, van Caam AP, Koenders MI, et al. Commercial cow milk contains physically stable extracellular vesicles expressing immunoregulatory TGF-beta. PLoS ONE (2015) 10(3):e0121123. doi: 10.1371/journal.pone.0121123 CrossRefPubMedGoogle Scholar
31. Yamada T, Inoshima Y, Matsuda T, Ishiguro N. Comparison of methods for isolating exosomes from bovine milk. J Vet Med Sci (2012) 74(11):1523–1525. doi: 10.1292/jvms.12-0032 CrossRefPubMedGoogle Scholar

Beheerder Vincent W Schoers

Copyright © 2021 door zorgdatjenietslaapt.nl. Toestemming tot gehele of gedeeltelijke herdruk wordt graag verleend, mits volledige creditering en een directe link worden gegeven.

Mijn lichaam is geen eigendom van de staat. Ik heb de uitsluitende en exclusieve autonomie over mijn lichaam en geen enkele politicus, ambtenaar of arts heeft het wettelijke of morele recht om mij te dwingen een niet-gelicentieerd, experimenteel vaccin of enige andere medische behandeling of procedure te laten ondergaan zonder mijn specifieke en geïnformeerde toestemming. De beslissing is aan mij en aan mij alleen en ik zal mij niet onderwerpen aan chantage door de overheid of emotionele manipulatie door de media, of zogenaamde celebratie influencers.

Alles hier gepubliceerd reflecteert de mening, ziens-, denkwijze van de gene die het plaatst