Samenvatting…
In Denemarken werd gevaccineerd tegen Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS-CoV-2) met de mRNA-vaccins van Pfizer-BioNTech (BTN162b2) of Moderna (mRNA-1273). Patiënten met chronische hepatitis C-virus (HCV)-infectie die in onze kliniek werden gevolgd, kregen mRNA-vaccinaties volgens het Deense uitrol-vaccinatieplan. Om de HCV-infectie te controleren werd RNA geëxtraheerd uit patiëntenplasma en werd RNA-sequencing uitgevoerd op het Illumina-platform. In 10 van 108 HCV-patiëntmonsters werden tot 28 dagen na de COVID-19-vaccinatie volledige of sporen van SARS-CoV-2 spike mRNA-vaccin-sequenties in het bloed aangetroffen. De detectie van mRNA-vaccinsequenties in bloed na vaccinatie voegt belangrijke kennis toe over deze technologie en moet leiden tot verder onderzoek naar het ontwerp van lipide-nanopartikels en de halfwaardetijd van deze en mRNA-vaccins in de mens.
Inleiding..
Met de noodgoedkeuring door de FDA van twee mRNA-vaccins in december 2020, en vervolgens een zeer grootschalige vaccinproductie en massa-immunisatieprogramma’s, werd een doorbraak bereikt in beschermende maatregelen tegen de wereldwijde pandemie met het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Zowel de vaccins van Pfizer-BioNTech (BTN162b2) als die van Moderna (mRNA-1273) coderen voor de productie van het volledige SARS-CoV-2 spike-eiwit. Om de stabiliteit te garanderen zijn deze vaccins samengesteld uit codon-geoptimaliseerd gemodificeerd spike mRNA, hebben ze twee stabiliserende proline substituties, en is het mRNA ingekapseld in lipide nanodeeltjes (LNP’s) [1, 2]. De gewijzigde nucleotidesequenties maken een perfecte identificatie mogelijk van de vaccinsequenties als zijnde verschillend van enige coronavirussequentie. Bij intramusculaire injectie wordt het mRNA van het vaccin opgenomen door spier- en afweercellen, en getransporteerd naar de regionale lymfeklieren en geconcentreerd in de milt [3]. De vaccins bestaan uit niet-replicerend mRNA en zullen naar verwachting zowel in het cytosol na vertaling als op de injectieplaats op natuurlijke wijze uiteenvallen. De halfwaardetijd van mRNA translatie wordt geschat op kort, van uren tot een dag, en translatie wordt beschreven tot 10 dagen [4-6]. De Infectious Diseases Society of America (IDSA) deelt mee dat het mRNA van het vaccin snel wordt afgebroken door normale intracellulaire processen en stelt dat er geen bewijs is voor langdurige detectie van mRNA-vaccins in gevaccineerde personen door middel van RNA-seq [1, 7].
In Denemarken zijn de overheersende vaccins tegen Corona Virus Disease 2019 (COVID-19) de twee op mRNA gebaseerde vaccins van Pfizer-BioNTech en Moderna. Per 28 juli 2022 heeft 80,2% van de bevolking twee doses ontvangen en 81,6% ten minste één dosis [8]. In het Universitair Ziekenhuis van Kopenhagen, Amager-Hvidovre, Denemarken, worden patiënten met chronische hepatitis C-virus (HCV)-infectie routinematig gevolgd op de afdeling Infectieziekten, terwijl meting van de HCV-virusbelasting en genotypering door whole RNA-Seq genoomsequencing van hun HCV RNA, rechtstreeks uit plasmamonsters, worden uitgevoerd op de afdeling Klinische Microbiologie [9]. In dit artikel beschrijven wij de onverwachte vondst van mRNA-sequenties van het SARS-CoV-2-vaccin in plasma van 10 HCV-patiëntmonsters tot 28 dagen na de COVID-19-vaccinatie. Deze patiënten hadden onlangs SARS-CoV-2 mRNA-vaccinaties gekregen volgens het Deense uitrol-vaccinatieplan.
Methoden…
Wij analyseerden vijf opeenvolgende sequencing runs, van mei 2021 tot eind juni 2021, met 108 HCV-patiënten, vijf negatieve controles en vijf HCV-positieve controles bestaande uit HCV gekweekt in celkweek [10]. De monsters waren afkomstig van patiënten die HCV-positief waren en kwamen voor evaluatie van de HCV-behandeling, zonder verband met hun vaccinatiekenmerken. De procedure voor directe RNA-sequencing (RNA-seq) is eerder beschreven [11]. Kort gezegd werd RNA geëxtraheerd met de ZR viral RNA kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA) en gedepleteerd voor menselijk rRNA met de NEBNext rRNA depletion kit (New England BioLabs, Ipswich. MA, USA). Gestrande RNA-seq bibliotheken werden bereid met de NEBNext Ultra II directionele RNA library prep kit (New England BioLabs). Sequencing werd uitgevoerd met 2 × 150-bp gepaarde-end leest op een NextSeq instrument (Illumina, San Diego, CA, USA).
Alle software werd gebruikt met standaard parameters, tenzij anders aangegeven. Ruwe leest werden getrimd voor basen van lage kwaliteit met fastp v 0.20.1 met minimale phred kwaliteit van 20 en minimale lengte van 50 [12]. Menselijke uitputting werd gedaan door het in kaart brengen van de getrimde leest naar het menselijk genoom hg38 (GenBank accession no. GCA_000001405.27) met Bowtie2 v 2.3.4.1 het toevoegen van de parameters -k 1 -X 2000 [13]. Gepaarde leest unmapped naar het menselijk genoom sequenties werden de novo gemonteerd met VICUNA v 1.3 met minimale contig links* van 2 en minimale identificeren van 90 [14]. Als onderdeel van onze pijplijn, zijn contigs boven 1000 bp uitgelijnd tegen NCBI’s nt database met behulp van BLASTn v2.8.1 + met een minimale waarde drempel van 1 e-22 [15]. Contigs die bleken aan te sluiten bij coronavirus-sequenties werden vervolgens uitgelijnd tegen twee assemblages van SARS-CoV2-spike-coderende mRNA-vaccins, BNT-162b2 en mRNA-1273 met behulp van BLASTn voor bevestiging [16]. Gepaarde lezingen werden ook in kaart gebracht tegen de twee vaccinassemblages met behulp van BWA-mem v 0.7.16 en SAMtools v 1.2 binnen de NASP-pijplijn v 1.1.2 [17-20]. Statistieken van het aantal gelezen mapping en dekking werden alleen berekend voor de coderende regio van het SARS-CoV-2 spike-gen waarbij de 5′ en 3′ UTR werden vermeden, aangezien deze regio’s een hoog percentage overeenkomst vertonen met menselijke genregio’s. De dekking werd berekend met BEDTools v 2.30.0 en uitgezet in R v 3.6.1 met ggplot2 [21-23]. SNP calls werden gegenereerd met HaplotypeCaller van GATK v 4.2.0.0 en gefilterd op heterozygoot genotype, mapping quality van <30 en symmetrische odds ratio van >3 [24]. Consensussequenties werden gemaakt in GATK en basen bedekt met minder dan 10 gelezen werden gemaskeerd met BEDTools.
*Een contig (van contiguous ) is een reeks overlappende DNA-segmenten die samen een consensusgebied van DNA vertegenwoordigen. In bottom-up sequencing– projecten verwijst een contig naar overlappende sequentiegegevens; in top-down sequencing- projecten verwijst contig naar de overlappende klonen die een fysieke kaart van het genoom vormen die wordt gebruikt om sequencing en assemblage te begeleiden.Contigs kunnen dus zowel verwijzen naar overlappende DNA-sequenties als naar overlappende fysieke segmenten (fragmenten) in klonen, afhankelijk van de context.
De beste (hoogste dekking) spike-sequentie voor het Pfizer-BioNTech-vaccin en de twee beste spike-sequenties voor het Moderna-vaccin zijn geüpload naar NCBI (GenBank accession numbers OK120840-OK120842). Hiaten in de sequenties worden weergegeven met N’s. Goedkeuring door een institutionele beoordelingsraad was niet vereist, aangezien dit onderzoek werd uitgevoerd als een operationele activiteit in verband met patiëntenbeheer.
Resultaten…
De novo assemblage van menselijke RNA-seq fragmenten van twee patiëntenmonsters leverde contigs op van >1000 nt met de grootste homologie met het vleermuis-coronavirus en 67% homologie met het SARS-CoV-2 referentiegenoom (NC_045512.2). Vertaling van de nucleotide-sequenties van de contig naar aminozuursequenties toonde 100% identiteit met delen van het spike-eiwit van SARS-CoV-2. Uit de literatuur vonden wij de sequenties van de twee commerciële SARS-CoV-2 mRNA-vaccins, die werden gebruikt als referenties om de reads van alle monsters in kaart te brengen [16, 25]. Dit leidde tot de identificatie van nog eens acht monsters met lezingen die overeenkwamen met de sequenties van het mRNA-vaccin. Beide mRNA-vaccin-sequenties zijn gewijzigd en zijn op nucleotidenniveau slechts ~70% identiek aan het spike-referentiegenoom, waardoor zij verschillen van circulerende infectieuze SARS-CoV-2-sequenties. Zo hadden 10 van de 108 patiëntenmonsters (9,3%) gedeeltelijke of tot volledige sequenties van de mRNA-sequentie van het vaccin (fig. 1), geïdentificeerd van één tot 28 dagen na de vaccinatie. Er was ~100% identiteit tussen de gedetecteerde mRNA-nucleotidesequenties in plasma en het specifieke gegeven mRNA-vaccin. De 10 monsters hadden een mediaan van 5,5 miljoen ruwe leesparen beschikbaar (zie tabel S1). De breedte en diepte van de dekking van de mRNA-sequenties van het vaccin varieerden van respectievelijk volledigheid en >20 000 tot korte fragmenten met een dekkingsdiepte van 100 (Fig. 1). Geen van de negatieve of HCV-positieve controles had SARS-CoV-2 matchende reads.
Fig. 1
Mapping van getrimde en gefilterde reads naar de coderende regio’s van het spikeiwit van het Moderna mRNA-vaccin of het Pfizer BioNTech-vaccin. Elke gekleurde plot is een enkel monster. De rechterkolom toont de dag na de vaccinatie, het gegeven vaccin dat in het bloed is gevonden en of het monster is genomen na 1. vaccinatie of hervaccinatie. De twee onderste monsters zijn van dezelfde patiënt na de eerste en de tweede vaccinatie met het Moderna-vaccin.
Discussie…
Wij vonden verrassend genoeg fragmenten van het mRNA van het COVID-19-vaccin tot 28 dagen na de vaccinatie in het bloed van chronische HCV-patiënten die waren gevaccineerd met mRNA-vaccins van zowel Pfizer-BioNTech als Moderna.
De analyse van de werking van het mRNA-vaccin heeft zich toegespitst op de immuunrespons en op de bescherming van gevaccineerde personen tegen door SARS-CoV-2 geïnduceerde ernstige COVID-19 [26, 27]. Er is gemeld dat de LNP’s snel worden opgeruimd door immuuncellen en dat het mRNA wordt afgebroken door exonucleasen in weefsel en bloed [28-30]. In een recente studie werd het vaccin-mRNA niet gedetecteerd door kwantitatieve PCR in menselijke melk na 4-48 uur postdosis 1 of 2 met BNT162b2 of mRNA-1273 [31].
RNA-seq wordt veel gebruikt in biologisch en medisch onderzoek. Wij gebruiken routinematig totale RNA-seq om HCV RNA-sequenties van volledige lengte te verkrijgen en daaruit het genotype af te leiden. Onze pijplijn omvat taxonomische analyse van contigs van meer dan 1000 nt die leidde tot de ontdekking van coronavirussequenties die bij de eerste analyse de grootste identiteit vertoonden met een vleermuiscoronavirus.
Wij verwachten dat het in plasma gedetecteerde mRNA van het vaccin zich in LNP’s bevindt en dat de LNP’s in plasma langzaam van de injectieplaats zijn vrijgekomen, hetzij rechtstreeks in het bloed, hetzij via het lymfesysteem. Zonder de LNP’s die het mRNA beschermen, zou het mRNA snel worden afgebroken. Dit maakt een langdurige spike-eiwitproductie mogelijk, wat bij sommige personen een voordeel is voor een continue immuunrespons. In de huidige studies over de halfwaardetijd van mRNA-vaccins zou de halfwaardetijd van de LNP’s onderschat kunnen zijn, voornamelijk op basis van resultaten van halfwaardetijdstudies van mRNA in het cytosol van menselijke cellen.
In monsters waarin wij alleen fragmenten van het mRNA van het vaccin hebben waargenomen, zou dit erop kunnen wijzen dat de concentratie van LNP’s in plasma laag is. Dit is in overeenstemming met onze bevindingen dat de virale belasting van HCV hoger moet zijn dan 10.000 IE/mL om een volledig HCV RNA-genoom (~9600 nt) te verkrijgen, aangezien de genoomdekking correleert met de virale belasting. Het aantal mRNA-moleculen van het SARS-CoV-2-vaccin is daarom waarschijnlijk lager dan ~4000 IE/mL, wat de gedeeltelijke leesdekking verklaart die willekeurig over de sequentie van het coronavirusvaccin is verspreid.
Voor zover wij weten, is onze studie de eerste die Pfizer-BioNTech en Moderna COVID-19 mRNA-vaccinsequenties in bloed detecteert na vaccinatie, en biedt daarom nieuwe kennis over het tijdsbestek waarin het mRNA kan worden gedetecteerd. Deze studie onderzocht een cohort HCV-positieve patiënten met een vermoedelijk functioneel immuunsysteem, aangezien de meeste patiënten kunnen worden genezen, met negatief HCV RNA 12 weken na beëindiging van de behandeling met direct werkende antivirale middelen. Een toekomstig prospectief onderzoek naar de halfwaardetijd van mRNA-vaccins bij ontvangers van vaccins zou kunnen worden uitgevoerd met mRNA-vaccinspecifieke PCR’s. Deze bevindingen zijn interessant en moeten leiden tot verder onderzoek naar het ontwerp van LNP’s en de halfwaardetijd van LNP’s en mRNA-vaccins, maar benadrukt moet worden dat onze gegevens niets veranderen aan de conclusie dat beide mRNA-vaccins veilig en effectief zijn.
Bron: https://doi.org/10.1111/apm.13294
Verwijzingen:
Laat hier uw waardering achter over dit artikel
Abonneren op de nieuwsbrief is gratis en op elk moment opzegbaar.. Bij het verschijnen van een nieuwe blogpost verschijnt dit automatisch in je mailbox
Beheerder Vincent W Schoers
Copyright © 2021 door zorgdatjenietslaapt.nl. Toestemming tot gehele of gedeeltelijke herdruk wordt graag verleend, mits volledige creditering en een directe link worden gegeven.
Mijn lichaam is geen eigendom van de staat. Ik heb de uitsluitende en exclusieve autonomie over mijn lichaam en geen enkele politicus, ambtenaar of arts heeft het wettelijke of morele recht om mij te dwingen een niet-gelicentieerd, experimenteel vaccin of enige andere medische behandeling of procedure te ondergaan zonder mijn specifieke en geïnformeerde toestemming. De beslissing is aan mij en aan mij alleen en ik zal mij niet onderwerpen aan chantage door de overheid of emotionele manipulatie door de media, of zogenaamde celebratie influencers.
Alles hier gepubliceerd reflecteert de mening, ziens-, denkwijze van de gene die het plaatst
Geef een reactie